人着床后体内胚原肠化的scRNA分析

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文章信息

文章题目：Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo日期：nature
期刊：2021年11月
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04158-y
Data：

• human：http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer/result?queryFor=Experiment&eAccession=E-MTAB-9388

引用：

• mouse：http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer/result?queryFor=Experiment&eAccession=E-MTAB-6967
• human：http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer/result?queryFor=Experiment&eAccession=E-MTAB-3929

可视化：http://www.human-gastrula.net/
可视化shiny源码：https://github.com/ScialdoneLab/human-gastrula-shiny

尽管一个胚胎，但我认为应该是相当有用的一篇文章，可以部分解决体外胚中部分不保守的现象。感谢捐赠者。

分析流程

pipeline

背景

老话怎么说来着，人一生最重要的时刻不是你出生、结婚抑或死亡，而是原肠化...

原肠形成时所有多细胞生物发育的一个基本过程。藉由该过程，动物基本的身体结构开始发生，是协调细胞多样性的关键进程。在人类中，原肠胚形成发生在受精后的第三周，对于该阶段的理解相对有限。本文研究了人体内整个原肠胚的单细胞转录组图谱（E16-19），分析细胞类型并于体外模型进行比较。除了分析多能性细胞外，作者鉴定了PGC、红细胞和各种中内胚层细胞。总之一句话，这个数据杠杠有用。

摘要

人原肠化发生于第三周，持续一周多一点。因此，目关于人原肠化的认知，几乎完全基于从模型系统、历史样品和最近发表的体外培养模型外的推断，包括微孔培养ES、hES接种鸡胚和hES 的3D模型系统。作者收到了卡内基分期（CS）7的胚胎，相当于E16-19，做了以下分析。

结论

CS7 人原肠胚特征

卡内基分期如下：

【镜·界】胚胎镜检查的卡内基分期

该胚胎核型正常，男孩子，对应PCW2-3，样品完全完整且形态正常，包括带有羊膜腔的胎盘，体蒂和带有色素细胞的卵黄囊。解剖卵黄囊和体蒂，分离上覆羊膜的胚盘。胚胎背腹侧照片显示，PS延长大约到胚盘一半的位置，原结在PS 的发端可见。为了在测序时保存解剖信息，将胚胎细分为卵黄囊、头端胚和尾端胚。

经质控，剩余1195个细胞（665个尾端，340个头端，190个卵黄囊），所有细胞均有chr Y 基因表达，且XIST 几乎检测不到，证实没有母源细胞污染。所有细胞周期可见，indel 与其他数据集范围相近，表明基因组正常。

采用无监督聚类浆细胞分为11个亚群，结合解剖信息，将之分别鉴定，见上图。结合鼠猴数据，证实了该分类的准确性：

fig S2

细胞类型多样化

CS7 的epiblast cluster 给定义人primed state 的提供了新角度。为了确定体内primed和naive细胞的真实坐标，整合分析了一组公共数据，该数据包含了从morula-E7的scRNA data。细胞基本可以根据发育阶段分开，并将体外培养的naive和primed 的hESC映射到该数据集。作者发现naive ESC接近E6-7，而primed接近CS7 的epiblast，这证明了体外primed 基本可以代表体内primed state。当然，体内外的naive和primed仍显示出了一些差异，这表明体外体系需要进一步完善。同样用这种这方法，评估了体外原肠胚模型：

Fig2A.harmony整合

Fig_S3A-C

RNA速率分析显示，由epiblast发端，中内胚层一骑绝尘分成两支。DC1与细胞类型和空间位置相关，基于他们离epi的远近，反应了细胞的分化程度或“年龄”。例如，在原肠形成早期出现的胚外中胚层（extra-embryonic mesoderm）细胞比出现较晚的轴中胚层（axial mesoderm）细胞离epi更远（说实在的，这个图的点太大了，很多细胞都看不清）。将中胚层注释为早中晚（nascent, emergent and advanced mesoderm）三个阶段，其表达的markers有重叠（旁轴中胚层和侧中胚层）。这表明在该阶段，这些细胞并没有产生特定的中胚层亚型，而是处于过渡态：

fig2B

fig_S3D

FIG 4-1

FIG4-2

为了探索epiblast在原肠化过程中的变化，作者用epiblast、PS、初生中胚层和ectoderm 建了RNA速率模型。这一结果说明，由epiblast起，发生两个分支，一侧由PS发育到中胚层，一侧发育到ectoderm（为什么做这个呢，我认为是上面的图看不清楚epiblast的具体变化，ectoderm 并没有和epiblast分开，只有中内胚层两个大支，对应附图也是如此）。采用基于扩散映射的拟时分析，提供了一种方法来推断epiblast分化为ectoderm或进入PS并开始分化为 nascent mesoderm时的基因表达变化。我们可以检测到ectoderm markers（DLX5, TFAP2A and GATA3）确切上调，而早期神经诱导markers（SOX1, SOX3 and PAX6）和分化的神经元markers（TUBB3, OLIG2 and NEUROD1）无法检测到或表达极低；尤其是没有任何细胞表达 SOX3, PAX6, TUBB3三者中的任两者。这表明CS7中神经分化尚未开始：

fig 2C

fig S5

小鼠是研究哺乳动物原肠化的主要模型。为了无偏测试人鼠原肠化之异同，作者采用拟时分析来比较二者epiblast到nascent mesoderm 之间的等价细胞群。鉴定出二者共有662个基因延发育轨迹差异表达，大多数（531）在拟时轨迹中具有相同趋势（皆增-117；皆减-414）。举个栗子，二者从epiblast到nascent mesoderm转变过程中，CDH1表达降低，TBXT瞬时表达，SNAI1持续上升。当然也有二者不同趋势的基因，如SNAI2仅在人中上调，TDFG1二者相反，FGF8仅在鼠中瞬时表达，FGF2人下调鼠不表达：

fig S6

fig 2D

为了验证这种人特异转录趋势，作者将hES分别诱导为经EMT的ME（正常发育走向）和用PD抑制MEK通路的非EMT的ME（非正常走向），证实了上图d的结果：

fig 2E-F

fig S7

将这一比较延伸到食蟹猴中（王红梅组dpf16 体外培养胚胎，看了三个通路配体受体表达）：

fig S8

Cluster 细胞亚型

Ectoderm (amniotic/embryonic) cluster在神经板吻侧表达 embryonic ectoderm markers，这些细胞将产生surface ectoderm 和amniotic ectoderm。对这部分细胞再分析发现分为俩群，一个代表amniotic ectoderm，高表达VTCN1和GABRP；另一个要么是神经板吻侧的embryonic  non-neural ectoderm，要么是未成熟羊膜：

fig 3A

PGC是起源于早期epiblast的关键细胞群。在小鼠中，PGC约在E7.25出现。最近的工作表明，非人灵长类动物和体外人胚的E11可鉴定出PGC markers，作者在PS cluster中可以检测到少量PGC。本文数据与人猴比较确定了PGC一些相同或不同的markers：

fig 3B

根据基因表达和解剖注释发现，endoderm cluster具备高度有序的亚结构。亚群分析显示有四个cluster：hypoblast、yolk sac和两个终末内胚层；与小鼠E7.25 endoderm 共比较证实了该注释的可靠性，两个终末内胚层占据了尾端胚胎大部分细胞，它俩主要区别就是细胞周期的差别。与DE2相比，DE1的增殖能力更强；DE2中anterior endoderm markers 如 HHEX, OTX2, SHISA2 和CER1表达增加。转录本亚型分析还揭示了这些内胚层cluster在诸如APOA2 和TTR等markers上差异表达。

fig 3C

fig S9

造血祖细胞的成熟

初步分析发现了两个血液相关的cluster，即幼红细胞（erythroblasts）和血内皮祖细胞（haemato-endothelial progenitors，HEP）。幼红细胞与yolk sac中的色素细胞及胚胎球蛋白基因表达一致，但在小鼠中没有同期的色素血细胞。XIST和Y染色体特异性基因的表达排除了这些细胞的母源来源可能性：

fig 4A

fig S10-A

HEP的无监督聚类包含四个亚群：endothelium（内皮细胞）、megakaryocyte-erythroid progenitors（巨核细胞-红细胞祖细胞，同时表达巨核细胞和红细胞markers）、myeloid progenitors（髓系祖细胞）和 erythro-myeloid progenitor（红系骨髓祖细胞，EMP）。扩散映射分析显示了HEP的亚型分离：

fig 4B

fig 4C

fig S10-B

fig S10-CD

FIG S10-EF

含血红蛋白细胞和多个造血祖细胞群的存在表明，与同期的小鼠胚胎（E6.75-E7.5）相比，人造血相关发育的更远。为证实这一点，作者联合E6.5-E8.5的小鼠胚胎数据分析发现，与人epiblast和PS同期的E7.0-E7.5相比，人造血细胞群更接近E8.5细胞。这证实了作者的推断：

fig 4D

fig S10-G

fig S10-H

讨论

1. 作者保证这枚胚胎发育正常；

2. CS7已出现PGCs和红细胞，但尚未启动神经分化；

3. 人鼠epiblast-mesoderm 的信号通路大致相同；

4. EMT人鼠间可能不保守；

5. 应该将人的这批数据和兔子、鸡或者其他非人灵长类比较，这样可以明确人鼠差异在多大程度上是仅进化不同，或是形态学差异所致。

方法

Raw data处理

Salmon 定量，参考基因组GRCh38.p13，比对模式quasi-mapping-based，生成gene-count矩阵，保留基因数> 2000、比对率>55%、线粒体比例<2%、ERCC比例<20%。scran包用于normalize，再进行ln(x+1)转化。

Cluster和细胞鉴定

图聚类，调用scanpy，鉴定top4000高变基因，细胞间距离用根号下(1 − ρ)/2计算，ρ是spearman相关。随后用scanpy 的neighbors，调方法为UMAP计算邻域，最后用Leiden 算法cluster。

Cluster间的差异基因用Wilcoxon 秩和检验分析，用Benjamini-Hochberg 矫正，再将FDR排序。然后scale数据，范围为0-1画热图。

Isoform分析

Salmon包含该数据。将之转为cpm，筛掉比对大于80% single isoform，卡方检验分析isoform差异。

拟时分析和速率分析

diffmap建轨迹，坐标用于RNA速率。用STAR比对，将bam文件扔到velocy 中，用默认的run-smartseq2模式处理，随后筛掉<10 splice 的基因，用 scVelo计算速率矩阵。

拟时分析则将DC1最高的细胞定义为根，用R包 gam 拟合基因表达水平，将拟时值转为1-dpt方便画图。

人鼠EMT比较

方法和上面差不多，先进行物种内分析，再取同源基因，将矩阵分别按照各自的最大表达值进行归一化。

小鼠cluster和血液分期分析

将基因表达中位值作为小鼠每群的pattern， R包scmap 的scmapCluster计算人与之最相近的cluster。

关于scmap，见周运来博文：

https://www.jianshu.com/p/cd710fa2791a

跨物种信号比较

从MSigDB 上下载FGF、WNT 和 BMP 三个通路基因，用秩和检验的w计算z-score，代码如下：

Z=(abs(W-n*(n+1)/4)-0.5)/sqrt(n*(n+1)*(2*n+1)/24)

细胞周期

用这篇文章 Computational assignment of cell-cycle stage from single-cell transcriptome data 里的方法计算细胞周期，python链接如下：

https://pypairs.readthedocs.io/en/latest/documentation.html

人和非人灵长类动物比较

王红梅组数据，用Seurat整合，计算每个cluster的平均表达水平，再做层次聚类。

PGC鉴定和跨物种比较

调用RaceID 对PS进行分析。小鼠取了E7.5的epi、PS和PGC，猴取了L-epi、L-gast1和PGC。计算PGC zscore画图。

Indel 分析

比较了人胎肝数据集。有类似的文章解读如下：

https://www.jianshu.com/p/7b67830692db

本文参考为 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6659636/

将数据trim到一样长，用bwa比对分析，参考数据集为这篇文章：Indel detection from DNA and RNA sequencing data with transIndel。

头尾端中胚层差异基因分析

DESeq2 ，Seurat。先创建seurat对象，然后将之转为DESeq2对象，FDR<0.1，同时控制了板子间的差异。

hESC比较

E3-7的胚胎，选择log10(x) > 5.5的细胞分析。这篇文章我写过解读，链接如下：

https://mp.weixin.qq.com/s/XumW4_kl3ck7dRFv52L9yw

CPM标准化，用harmony和seurat整合。E6中提取细胞将之定义为naive，计算CS7和E6的HVG分析。

人体外原肠胚比较

用了这篇文章：An in vitro model of early anteroposterior organization during human development 的数据。空转数据。处理方法和上面提到的相差不大。空转数据我不太熟悉，就不列方法了。

总结：

很好的分析方法，很好的数据，都值得参考。

往期回顾

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